甲氧苄氨嘧啶可竞争地抑制细菌二氢叶酸还原酶，从而阻断四氢叶酸的合成。它与磺胺类药物合用可使细菌的叶酸代谢受双重阻断，抗菌作用大大增强，甚至达到杀菌的效果，且可减少耐药菌株的产生。TMP还可增强四环素、庆大霉素等多种抗生素的抗菌作用。